Chimie

Méthodes de génie génétique

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Réalisation de l'expérience : isolement de l'ADN plasmidique selon la méthode du minilysat

Lors de la manipulation d'acides nucléiques, il faut toujours veiller à ce que tous les matériaux soient exempts de nucléases. Les tampons, solutions, pointes de pipettes et tubes Eppendorf doivent être stériles et ne doivent pas être touchés sans gants, car des nucléases peuvent également se trouver sur la peau.

Protocole de travail pour l'isolement de l'ADN

Le soir de la veille, 12 colonies, chacune avec une pointe de pipette jaune, sont transférées d'une plaque de gélose (noter le nom) avec des colonies individuelles dans un tube de culture avec 3 ml (100 µg /mlAmpicilline). Ces 12 tubes de culture sont conservés une nuit (ou au moins 5 heures) à 37 °C incubé dans le rouleau ou sur le shaker.

Le lendemain, environ 1,5 ml de la culture est versé dans des tubes Eppendorf étiquetés avec la pipette de 1000 µl (soit un total de 3 ml par approche) et pour 5 min centrifugé à 6 000 tr/min dans une centrifugeuse de table. Le surnageant est décanté et le liquide résiduel est éliminé en le frappant doucement, de sorte qu'il ne reste pratiquement que le culot.

Le culot est mélangé avec 100 µl de tampon P1 et complètement suspendu à la pipette ou au vortex, une vraie solution n'est pas encore obtenue à ce stade.

Maintenant 200 ul de tampon P2 sont ajoutés dans chaque cas. Après chaque addition, le récipient correspondant est immédiatement retourné avec précaution et lentement bien mélangé par tours supplémentaires. Cette étape doit être échantillon par échantillon avec 30 s Distance les uns des autres. Les récipients de réaction représentent maintenant chacun 5 min sur la glace. Dans cette étape, l'ADN entier est dénaturé avec des moyens alcalins. Dans le même ordre et avec le même intervalle de temps, après le 5 min 150 µl de tampon P3 chacun sont ajoutés (NaOAc est particulièrement soluble dans le mélange alcool-eau). Après une brève secousse, les vaisseaux restent pendant 30 min sur la glace.

Noter
Après l'ajout de SDS et de NaOH, la suspension ne doit être mélangée qu'en retournant le tube Eppendorf et en aucun cas sur le vortex. Sinon, les forces de cisaillement conduisent à ce que l'ADN chromosomique soit fortement fragmenté et ne soit plus séparable de l'ADN plasmidique. L'étape de lyse ne doit pas dépasser cinq minutes afin que l'ADN plasmidique ne soit pas excessivement dénaturé.

En attendant, 12 nouveaux tubes Eppendorf sont étiquetés et chacun avec 1 ml 99% d'éthanol rempli. Ces navires restent également sur la glace.

Les échantillons prétraités avec les tampons sont traités après le 30 min dans le Biofuge 10 min centrifugé à 13 000 tr/min. Immédiatement après, le surnageant est décanté dans le récipient Eppendorf associé rempli d'éthanol à 99% froid. De plus petites quantités de surnageant restent dans le récipient de réaction. Après les avoir retournés plusieurs fois (un mélange minutieux est absolument nécessaire), les embouts sont ensuite placés dans la Biofuge 20 min centrifugé à 12.000 rpm.

Noter
Important : Veuillez placer les récipients dans la centrifugeuse de manière à savoir exactement où se trouve le culot après la fin de l'analyse. Les pastilles d'ADN ne sont pas visibles, surtout si l'ADN est très propre !

Le surnageant de centrifugation est prélevé autant que possible avec la pipette Pasteur et jeté. La pointe ne doit pas endommager le pellet au cours du processus (guidez-le le long du mur opposé) ! Puis 1 ml 75% d'éthanol glacé ajouté (ne pas secouer !).

Noter
Important : L'éthanol ne doit pas être à 100 %, sinon le sel précipiterait à nouveau. Au lieu de l'éthanol à 75 %, aucune eau ne doit être utilisée pour le lavage, sinon l'ADN se dissoudrait à nouveau.

Les échantillons sont placés dans la biofuge comme précédemment et 5 min centrifugé à 13 000 tr/min. Le surnageant est à nouveau soigneusement pipeté et les échantillons au dessiccateur pendant 15 min séché. Si suffisamment de temps est disponible, le séchage à l'air peut également être effectué - plus le processus de séchage est doux, plus les coques hydratées sont conservées et plus il est facile de détacher l'ADN par la suite. L'ADN séché est ensuite dissous dans 50 ul d'eau bidistillée stérile. Eau absorbée et bien remise en suspension.


Vidéo: Le génie génétique pour les SVT et préparation médecine (Juillet 2022).


Commentaires:

  1. Balkree

    Bien sûr, je m'excuse, mais c'est complètement différent, et pas ce dont j'ai besoin.

  2. Treowbrycg

    On peut dire infiniment sur cette question.



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